Nature Reviews|如何利用高通量测序发掘细菌耐药性基因?

自从1929年英国细菌学家费莱明发现了世界上第一种抗生素-青霉素,抗生素就一直被用作治疗细菌感染的强力武器,但由于人类的滥用,抗生素反倒成为当今医疗卫生的一大挑战。据统计,在美国,对一线抗生素具有耐药性的细菌每年感染200万人,这些感染造成的医疗费用高达200亿美元。而在欧洲,耐药性细菌每年也无情夺走30000人的生命。

2014年,世界卫生组织(WHO)发布了全球首份抗菌药耐药报告——《抗菌素耐药:全球监测报告》,这份针对全球114个国家的检测数据显示全球都在面临抗菌药耐药的重大威胁,一场人类与细菌耐药性的斗争也正式拉开帷幕。

虽然经过广泛的研究和报道,人类已经开始意识到滥用抗生素的危害,但是耐药菌的发现却从未停止,且几乎所有抗生素都存在相应的耐药菌(图1)。此外,细菌中复杂的耐药性机制(图2)也使得有效和快速检测耐药菌成为一大科学界的难题。药敏试验(Antimicrobial Susceptibility Testing, AST)是最传统的耐药性检验方法,这种方法是使用目前已发现的抗生素以培养的方式来对细菌进行耐药性检验,由于这种方法操作简单且成本较低,因此广泛应用于各大医院临床微生物实验室。虽然AST能够为病人管理和耐药基因流行病学提供重要信息,但是这种方法仅能对可培养的细菌进行性检验,而不能对各种复杂环境中不可培养细菌进行研究。

经研究发现,细菌的耐药性通常是由基因编码获得的,如基因的过表达或复制、点突变或通过水平基因转移获得全新的基因(图3)。随着二代测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术和生信算法的提升,快速识别可培养和不可培养细菌中的耐药性基因和准确描绘细菌基因组及宏基因组的特征也成为了可能,这也弥补了AST法仅能检测可培养细菌的缺陷。与此同时,全世界各地科学家大规模地对人类、动物及环境基因组测序所获得的数据也为了解抗菌素耐药性基因的全球分布和耐多种药物细菌的传播提供了前所未有的见解。此外,这些数据的更新也为不同的环境和细菌系统发育如何影响全球抗菌素耐药性的进化动态实行了监测。

伴随着技术的不断发展,NGS技术的成本也不断地下降,这也使得越来越多的医疗机构有机会采用该方法进行耐药性检测。近年来,多个从全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)和全宏基因组测序(whole-metagenome sequencing,WMS)数据中检测耐药基因决定因素的方法和工具已被发表(表1),主要分为装配法(assembly-based methods)和读段法(read-based methods)两大类。装配法首先将测序平台测得的短读段拼接成连续的片段,再用现有的数据库对拼接的片段进行注释以找到耐药基因。而读段法则刚好相反,这种方法直接根据数据库分析读段,然后将读段与数据库相映射的方式来预测抗性决定因素。

装配法中细菌全基因组(WGS)和全宏基因组(WMS)的组装采用的是不同的组装算法。WGS通常采用de Bruijn graph (DBG)组装算法,这种算法能够高效地处理大量测序数据,但是很容易受到测序中错误读取的影响。而WMS的组装则需要使用相应针对性的宏基因组组装算法(metagenome-specific assemblers),因为WMS中不同生物的测序覆盖不均匀使得其组装比WGS更加复杂,难度更加大(图4)。

虽然WGS和WMS用于组装的算法有所不同,但他们的注释方式都是使用相似性搜索工具(similarity-based search tools),如BLAST、USEARCH或 DIAMOND等。凭借着出色的序列覆盖度,装配法通常可以提供蛋白质编码基因、调控序列信息和完整的基因组环境等信息,这些信息对研究耐药性的联合相关基因和生物途径有至关重要的意义。

与装配法不同,读段法则通过使用成对比对工具(如Bowtie2或BWA)将reads对齐到参考数据库,或者将reads拆分为k-mers再将其映射到参考数据库,最终在不进行基因组组装的情况下检测样本中的抗菌素耐药性基因(图5)。由于读段法可以直接对读段进行注释,对组装要求比较低,因此该方法对于读段不足以进行装配法检测的样品颇为有效。此外,与装配法相比,读段法能够降低结果对人类相关物种的固有偏好。读段法与装配法的最大不同是其无需进行从头到尾的拼接,大大减少了计算要求,但也因此不适合用于检测单核苷酸多态性(SNP)。

装配法和读段法对分离的病原菌和环境细菌中的抗菌素耐药性的预测在很大程度上依赖于抗菌素耐药性基因数据库,这些数据库将已知的抗菌素耐药性的遗传决定因素与它们所产生的表型耐药性紧密联系起来,以尽可能提供有意义的测序序列注释(表2)。

截止目前,科学家们仍旧没有在装配法和读段法的使用上达成共识,因为两个方法各有各的优势和缺陷。虽然装配法在序列拼接是会造成部分序列的丢失,但是可以识别蛋白质编码基因和研究上下游调节因子。尽管读段法不能够像装配法那样提供多种潜在信息,但是他能够有效地从复杂群落中存在的低丰度生物体中识别出抗菌素耐药性基因。因此选用装配法还是读段法需要根据实际的需求来选择。现在用于抗生素耐药性参考的数据库主要分为两种,分别是综合数据库(General Databases)和物种特异性数据库(Species-specific databases)。综合数据库涵盖大多数抗菌耐药基因及其作用机制信息,而物种特异性数据库可为特定的基因家族或物种提供全面耐药性的信息。

虽然抗生素耐药性的生物学研究已经取得了长足的进步,但是还是有一些因素阻碍了基于NGS技术的抗菌素耐药性检测的使用。一个主要的瓶颈是缺乏有效的管理策略,除少数例外情况外,抗菌素耐药性数据库缺乏有效和可持续的管理渠道。其次是许多抗菌素耐药性基因大多仅根据核苷酸序列和蛋白质序列来命名,这也导致命名的冲突。相互冲突的基因名和相近名在数据库中造成大量的冗余,并使用户感到困惑。此外,最重要的限制是目前的数据库大多仅关注蛋白编码的耐药性基因的本身,而忽略了抗菌素耐药性机制,如基因组变化、核糖体RNA (rRNA)基因的新生突变,以及调控元件和药物靶点突变等。

除了上述的AST法、装配法和读段法外,最近研究者们还研发出了一种不依赖于病原菌培养和无测序偏好的新型耐药性检测方法——功能宏基因组法(Functional Metagenomics),该方法通过克隆细菌群落的DNA来构建宏基因组文库,并将文库转化到易感性指示菌种中表达,最终挑选出能够在含有抗生素培养板上存活的重组菌进行测序以确定耐药性基因(图6)。

抗菌素耐药性目前是世界上一重大的公共卫生威胁。检测和了解抗菌素耐药性的流行、机制和传播是个体患者护理和全球感染控制战略的前提。虽然NGS技术已经打破了传统的AST法在耐药性检测上的诸多局限,但是NGS在细菌耐药性的检测上依旧存在许多不足,例如抗菌素耐药性参考数据库的管理不完善、高昂的仪器设备投入等。但无可置疑的是基于NGS的耐药性检测技术增强临床医生制定细菌感染治疗计划的能力,大大缩短了耐药性基因的发现周期。

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编译:RockyL

编辑:Rachel

审核:Jason